文献精读
再帕尔·阿不力孜科研团队第14期
中国医学科学院药物研究所
天然药物活性物质与功能国家重点实验室
文献整理、编辑：回相宜
指导教师：厉欣
免疫调节对于癌症进展至关重要，但是现有研究关于免疫组成、表型和与肿瘤相互作用的了解有限。来自美国斯坦福大学的SeanC.Bendall和MichaelAngelo等近期在Cell上发表了一篇文章，利用多重离子束成像（MIBI）的方法对三阴性乳腺癌患者组织微阵列进行质谱成像分析，同时采用机器学习的自动图像处理方法对视野内细胞进行提取并发现免疫细胞分布具有层次排列的规律。据此将41例患者样品分为：无免疫肿瘤细胞相互作用型、免疫肿瘤细胞混合型和免疫肿瘤细胞集中分布的区域化型。对免疫调节因子（IRP）的成像分析发现IRP存在共表达性且与区域化现象关联，提示免疫细胞区域化的患者可能更适用于复合免疫疗法。
介绍
“三阴性”乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体-2均为阴性的乳腺癌，具有较强的侵袭性。由于免疫应答的复杂性且TNBC患者没有单一的生物标志物来进行区分，因此关于TNBC免疫细胞与肿瘤作用关系的研究仍然十分有限。
多重离子束成像（multiplexedionbeamimaging,MIBI）技术（Angelo等，）利用抗体对于抗原特异性识别的特点，将抗体用镧系金属元素进行标记后特异性识别细胞表面抗原，二次离子化质谱法对金属离子进行检测，进而实现对细胞表面抗原的检测。与免疫组织化学的方法相比：1.对于含量较低的抗原，稳定性及线性好于免疫组化信号放大技术。2.可以用混合的标记抗体进行快速抗原抗体反应，不需要循环染色步骤。
结果
1.开发肿瘤免疫微环境多重成像分析方法
研究设计了含有36个反映肿瘤免疫微环境的特征抗原小组。其中包括：肿瘤相关抗原（如EGFR、p53等），增殖和代谢活动的功能抗原（如Ki-67、pS6等），免疫相关蛋白（如CD4?、FoxP3等）和4种目前在临床中靶向或正在进行免疫疗法、药物试验的免疫调节因子（PD-1?、PD-L1、LAG3、IDO等）。
MIBI-TOF的工作流程（图1A）是将临床福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样品置于载玻片上，用金属元素标记的抗体混合物染色过夜（Bendall等，）后将载玻片置于MIBI-TOF质谱仪中进行成像。双等离子体源经聚焦产生的纳米级O2+初级离子束扫描组织切片，组织上的金属被撞击后释放成为二次离子，通过飞行时间质谱仪被检测。组织切片上每个物理像素点生成的质谱数据被记录。
图1(A)：MIBI方法的工作流程（STAR方法）
MIBI成像技术应用于TNBC组织样品研究之前，将其应用于扁桃体，胃肠道，胎盘和乳腺癌组织（图1B）并进行多次实验，来评估检测灵敏度和特异性。
图1(B)扁桃体，胎盘，胃肠道和乳腺癌样品MIBI成像图
通过对来自人淋巴结的连续切片进行实验来证实系统高重复性（R=0.9，p10-20，图1C?）。MIBI技术能够在亚细胞分辨率下可靠地应用于36种抗原成像，其动态范围足以量化完整组织中的高丰度蛋白和低丰度蛋白。
图1(C)连续的淋巴结切片MIBI成像验证系统的高重复性
2.建立细胞图像自动分析方法，发现TNBC组织内免疫细胞有序构成
研究医院的41名TNBC患者的组织微阵列，进行分辨率为nm的成像分析，获得每个患者-个细胞的质谱数据，共计张图片。为此该研究人员开发了一种数据分析的计算方法，对于每个视野的质谱数据提取金属离子个数计数并转换成多维TIFF，使用空白质谱数据扣除背景，用K-最邻近方法过滤噪声，分位数归一化方法除去批次效应（图2A-F）。建立了从图像中提取细胞的方法，并使用手动提取两名患者组织成像视野中的细胞作为训练集，其余为验证集。训练集精度得分为74%，验证集为73%。
图2(A-F)组织微阵列中自动提取细胞质谱数据的方法
随后对微阵列上的细胞数目进行统计，发现免疫细胞数量存在跨越两个数量级的差异，以免疫组化（IHC）方法进行验证证实了这种发现。值得注意的是，患者免疫组成复杂程度与免疫细胞总数高度相关。例如，具有更多免疫细胞的患者倾向于具有更大比例的CD4+（阳性）T细胞（PearsonR=0.87，p10-12）和更小比例的巨噬细胞（PearsonR=0.71，p10-6）（图2I和2J。图2K表示绝对数量）。如果假设免疫浸润水平即免疫细胞总数可以作为肿瘤发生时间的标志，这些结果可能表明不同种类免疫细胞进入肿瘤微区存在时间差异排序。
图2(I)免疫表达细胞组成和数量关系，(J)辅助T细胞和巨噬细胞数量的规律分析
图2(K)免疫细胞的绝对数量及表达组成
随后实验人员发现患者的免疫表达之间存在显着的相互依赖趋势（图2L）。例如，具有B细胞的患者也具有CD4+T细胞和CD8+T细胞（分别为p0.，p0.）。具有NK细胞的患者也有B细胞（p0.01）。
图2(L)CD4+-T细胞和CD8+-T细胞的出现存在一定的关联性(X2pCD4-T:CD8-T0.,pNK:B0.)
3.TNBC组织中肿瘤细胞和免疫细胞的组织层次具有层级结构
为了评估TNBC中肿瘤细胞和免疫细胞的空间位置，STAR方法中通过将X、Y两种蛋白阳性的细胞分别设定为X、Y，对个Y像素（39μm）中X个数进行量化，随机化Y选区的位置，以Z得分代表两种细胞的距离，得到富集图，模拟组织微阵列上细胞的组成（图3A）。并在一些患者体内发现明确的细胞分布群组，一个族群表达免疫细胞标志物，而另一个表达肿瘤细胞标志物。其他患者表现出两种细胞分布随机性或单一存在肿瘤细胞（图3B）。
图3(A)随机化的方式及模拟微阵列，3(B)不同患者的组织微阵列样品呈现不同的细胞分布规律，图3(C)患者4和患者12在免疫细胞数量接近的情况下，具有不同的分布规律
将这种方法应用于不同患者的全部样品，显示出免疫细胞的空间分布存在多种程度的混合，且来自同一谱系细胞更容易出现聚集。同时树突细胞和中性粒细胞也有空间上向相同蛋白聚集的情况（图3D）。鉴定出由聚集的B细胞组成的三级淋巴结构（图3E,3F,3G1）。此外不同谱系但是表达特征相同的细胞也会出现空间接近性，例如Ki-67+细胞和肿瘤细胞聚集（图3E,3F,3G2）和IDO+细胞和免疫细胞聚集（图3E,3F,3G3）。提示这些细胞的聚集很有可能是受到微环境的影响。最后研究还证实了不同表型细胞的聚集，例如患者16表达IDO的细胞和表达PD-1的细胞的出现聚集（图3E,3F,3G4）。
3（D）依赖于上下文的空间富集分析用于分层组织,（E）患者16中蛋白质对之间的Z-评分的热图，3（F）突出显示3（E）中正方形部分，3（G）为3（F）中突出显示区域的蛋白成像
4.不同的TNBC细胞类型和患者具有差异化的免疫调节蛋白表达
为了描绘TNBC患者体内免疫调节情况，对四种现今被证明或者已经进行临床试验的免疫调节蛋白（IRP）进行靶向研究：细胞程序性死亡蛋白-1（PD-1）、细胞程序性死亡蛋白配体-1（PD-L1）、吲哚胺2,3-二氧合酶（IDO）、淋巴细胞活化基因3（LAG3）。该研究发现PD-1和LAG3主要由免疫细胞表达，而PD-L1和IDO在肿瘤细胞和免疫细胞中表达比例接近（图4A）。同时通过多重成像图及富集分析发现细胞对于免疫蛋白和IRP的表达特征与以往报道一致。例如，PD-L1在CD4+T细胞上聚集，PD-1在CD4+T和CD8+T细胞上聚集，LAG3在CD8+T细胞和调节T细胞上聚集，IDO和PD-L1在单核细胞上聚集（图4A,4B-C）。
图4(A)IRP之间的表达关联，4(B-C)多重成像和富集分析发现免疫蛋白与IRP表达关联，图4(D-E)具有IRP表达的细胞，图4(F)IRP共表达的不对称性分析，图4(G)所有患者的IRP表达情况富集
该研究对表达IRP的细胞进行多重分析（图4D，4E）发现LAG3与PD-1（39%）、PD-L1与IDO（35%）出现共表达的比例较其他组合更高。进一步分析发现，这种共表达的出现比例是不同的，例如表达PD-1的细胞中由15%表达LAG3，而表达LAG3的细胞种有35%表达PD-1，提示某种IRP调控蛋白的存在，暗示了免疫微环境对于免疫表达的调节（图4F）。将每位患者体内IRP的表达情况规定为存在与缺失，研究者经过富集分析发现，所涉及的41位TNBC患者体内大部分以IRP共表达或不表达的特点出现，较少患者（患者1,2,27,31,41）为IRP的单一表达型（图4G）。
5.免疫调节蛋白的表达模式与TNBC组织架构相吻合
研究者对每个患者免疫调节蛋白（IRP）的表达情况进行分类，发现一些患者主要是CD4+-T细胞出现PD-1+，另一些是CD8+-T细胞出现PD-1+，例如，患者35具有个PD1+免疫细胞，其中68％是CD4+，8％是CD8+。类似地，患者14具有个PD1+细胞，而其中7％是CD4+，78％是CD8+。（图5A，5J）。之后研究人员还发现不同细胞亚型的IRP表达与组织的混合与区域化结构相关（Wilcoxon秩和检验p=0.，图5A-5C）。
图5(A)两名患者组织中PD-1的表达组合，5(B)Wilcoxon秩和检验确定混合型肿瘤倾向于具有PD-1+，CD4+T细胞和PD-1+，CD8+T细胞，5(C)CD8，CD4和PD-1的颜色叠加，5(D-I)PD-L1、IDO在区域化肿瘤患者体内呈现差异性表达
研究者观察到PD-L1和IDO的类似结构关系。部分患者组织在肿瘤细胞比免疫细胞上表现出广泛的聚集的PD-L1或IDO表达（图5D-5F）。同时，免疫调节蛋白的聚集可能与肿瘤结构有关，其中混合肿瘤主要在肿瘤细胞上具有PD-L1和IDO表达，并且区域化肿瘤主要在免疫细胞上具有PD-L1和IDO表达（Wilcoxon秩和检验，IDOp=0.，PD-L1p10-4）。这些结果将细胞特异性表达谱与肿瘤的组织学联系起来，突出了多重成像可提供的多层信息。
图5(J)每个患者的四种IRP表达情况分类
6.肿瘤边界具有可免疫调节的复杂多细胞结构
为了进一步探索分子表达与组织结构之间的关系，研究者将重点放在肿瘤免疫边界上，并开发了一种计算方法可以从成像图中自动注释肿瘤免疫边界（图6A）。研究人员采用个像素（39μm）的阈值，按照细胞到边界的距离对细胞进行分类，然后提取每类细胞并进行Wilxocon秩和检验比较细胞表达分布。在患者4和9中发现了垂直于肿瘤边界的组蛋白H3甲基化（H3K27me3）和乙酰化（H3K9ac）水平的梯度（图6B）。由于H3K9ac与开放染色质和H3K27me3与闭合染色质相关，可能提示肿瘤免疫边界上的细胞较肿瘤中心的细胞更具有转录活性。
图6(A)自动计算的方法以白线标记肿瘤免疫边界，图6(B)肿瘤中心细胞较边界甲基化程度更高
为了更广泛的评估肿瘤的复发性，研究者对不同患者的标记物进行了显著性检查，分层聚类（6C）和主成分分析（6D）发现，B细胞耗尽沿肿瘤边界发生。此外研究者还确定了一部分存在明确边界效应的患者（4,5,9,10和40）。这些患者CD11c+，CD11b+细胞中PD-L1，PD-1和IDO表达出现上调，提示髓源性抑制细胞表型。这些患者也倾向于在边界附近有更高的人类白细胞DR抗原（HLA-DR）表达（图6E）。这种表达模式可能暗示细胞因子如IFN-γ的局部产生（Carrel等，）。
图6(C)分层聚类评估患者蛋白表达与边界距离的关系。6(D)对于(C)中黑色标记部分的PCA分析
图6(E)肿瘤免疫边界为黄色。边界附近的免疫细胞共表达IDO，PD-L1，CD11c+和CD11b+。肿瘤细胞表达HLA-DR，具有从边界向内的梯度
上述发现表明肿瘤免疫边界是免疫调节的独特位点，肿瘤和免疫细胞的表达谱改变位点。不同患者的蛋白质表达谱提示了蛋白质空间表达特征，可以对具有相似肿瘤免疫相互作用的患者进行分层（图7A）。最后，研究者考察肿瘤免疫情况是否与预后相关，将患者分成无细胞作用组、区域化组和混合组。由于无细胞作用组只有5名患者，所以进一步分析中将其舍弃。区域组织与存活率增加相关（Cox回归HR=4.97，p=0.03图7B）。这表明TNBC的临床结果受肿瘤免疫微环境的影响，并强调免疫系统的对于生存期的重要性，即使在非免疫治疗环境中也是如此。
图7(A)描绘TNBC中三种肿瘤免疫组成和组织的原型。无细胞作用组的免疫细胞很少，主要是巨噬细胞、混合组肿瘤和免疫细胞混合在一起。IDO和PD-L1，主要在肿瘤细胞上和PD-1CD8+T细胞表达。区域化组中免疫和肿瘤细胞在空间上分离。中性粒细胞在边界附近聚集，而B细胞在更远处形成次级淋巴结构。IDO和PD-L1主要在免疫细胞和PD-1上表达CD4+T细胞。肿瘤子集表达HLA-DR，具有从边界朝向肿瘤中心的HLA-DR和H3K9ac/H3K27me3的梯度，7(B)Kaplan-Meier曲线显示具有区域化或混合的肿瘤免疫组织的患者的存活率随时间的变化。使用Cox回归分析计算危害比（HR）和p值
讨论
MIBI质谱成像方法回顾性分析了TNBC组织内免疫细胞与肿瘤细胞的聚集方式及规律。解释了细胞表型和组织分布之间存在的关联。对免疫细胞与肿瘤细胞的内在表达蛋白特性进行了分析，免疫蛋白不仅在数量上，而且在表达来源细胞类型上也存在较大差异，这些差异在区域化类型的患者中尤为明显。将这些微环境免疫特征与TNBC现有分子数据相关联，有望为患者分层和个体化治疗方案设计提供新方向。
参考文献：MichaelA.,SeanC.B.,et.al..Nat.Med.20,-,()
CarrelS.,Schmidt-KessenA.,GiuffrèL.Eur.J.Immunol.15:-,()
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