编程般依序释药治肿瘤——外泌体膜包载的程序性激活仿生前药纳米粒捕获，用于清除循环肿瘤细胞、抑制乳腺癌转移
汇报人：研究生二年级梁启凡
乳腺癌的转移与其高死亡率密切相关。尽管在纳米技术的抗转移治疗中发展迅速，但抗转移效率仍远不能令人满意，这主要是由于针对血液中循环肿瘤细胞（CTC）的识别能力差。在这里，我们开发了一种外泌体包载的顺序生物激活前药纳米平台（EMPCs）来克服这一障碍。具体而言，将活性氧（ROS）响应的硫醚连接的紫杉醇-亚油酸共轭物（PTX-S-LA）和葫芦素B（CuB）共包裹到聚合物胶束中，并用外泌体膜（EM）进一步修饰纳米颗粒。通过癌细胞膜和同型外泌体之间的高亲和力相互作用，所制备的EMPC可以在血液循环过程中特异性捕获和中和CTC。在细胞摄取后，EMPC首先释放CuB，通过下调FAK/MMP信号通路显着阻断肿瘤转移。此外，CuB明显提高了细胞内的氧化水平，以诱导ROS响应性PTX-S-LA的顺序生物激活。体外和体内结果表明，EMPCs不仅表现出增强的前药生物激活，延长的血液循环，对同型肿瘤细胞的选择性靶向以及增强的肿瘤渗透性，而且还通过CTC清除和FAK/MMP信号通路调节来抑制肿瘤转移。这项研究提出了一种基于机制的肿瘤转移抑制综合方法，并显示了可序贯生物激活前药纳米平台对癌症转移抑制的潜在潜力。
Biomaterials杂志发表的外泌体膜包被序贯激活仿生前药纳米粒捕获清除循环肿瘤细胞，抑制乳腺癌转移的研究报道。
沈阳药科大学无涯创新学院孙进教授团队证实：将外泌体包被装载有活性氧响应的紫杉醇-亚油酸共轭物和葫芦素B的聚合物胶束，通过癌细胞膜和同型外泌体之间的高亲和力相互作用进而捕获循环肿瘤细胞，释放制剂中的葫芦素B成分，通过下调FAK/MMP信号通路来抑制肿瘤细胞的转移能力，并提高细胞内的活性氧含量；进而激活紫杉醇-亚油酸共轭物，释放紫杉醇，对肿瘤细胞进行靶向化疗药物治疗。对乳腺癌的生长与转移均具有很好的抑制效果，且生物安全性好，这一策略为癌症治疗提供一种新的思路。这一研究发现发表在年7月15日的Biomaterials杂志上。
图1
图1具有CTC清除，CuB介导的转移抑制，ROS增强和级联扩增PTX化疗的外泌体包被连续生物激活紫杉醇前药纳米平台的示意图。
研
究
背
景
肿瘤的重要器官转移占肿瘤死因的90％，循环肿瘤细胞（CTCs）在肿瘤转移中起着重要作用。化学疗法作为肿瘤治疗的一般方法很难清除CTCs，因此小分子化疗药物对转移的抑制作用有限。已有研究证明CTCs在血流中相互聚集，以延长存活时间并在重要器官构建转移灶，这种同源聚集是由CTCs膜上过表达的结合蛋白之间的高亲和力相互作用介导的。
外泌体是40-nm大小的细胞外囊泡，由各种类型的细胞广泛分泌，包括肿瘤细胞，免疫细胞，干细胞和内皮细胞等。它们在长距离和短距离的细胞间通信中起着至关重要的作用。有研究在肿瘤来源的外泌体膜中发现了各种特定的表面粘附分子，它们介导了对同源肿瘤细胞的靶向，同时外泌体膜上高表达的CD47蛋白可以帮助外泌体逃脱巨噬细胞的吞噬作用。据我们所知，此前还没有外泌体膜包被仿生纳米颗粒靶向清除CTCs并抑制肿瘤转移的报道。外泌体膜修饰的策略可以帮助纳米粒子规避巨噬细胞的吞噬作用，并靶向原发肿瘤，识别CTCs。
由于肿瘤细胞中活性氧（ROS）的过量表达，近年来，旨在实现肿瘤特异性活化ROS响应性前药策略发展迅速。但是，肿瘤细胞中的内源性ROS水平不足以及肿瘤异质性严重阻碍了前药的快速有效激活。已有多种ROS扩增策略（包括协同光动力疗法，借助芬顿反应，与葡萄糖氧化酶共递送等）用于增强ROS响应前药的生物活化。在这项研究中，ROS响应前药可以通过共载的葫芦素B介导的ROS级联扩增增强活化。葫芦素B是一种从葫芦科植物中提取的四环三萜类分子，通过下调FAK/MMP信号通路抑制乳腺癌的粘附，迁移和侵袭。此外，葫芦素B可介导各种肿瘤细胞系中快速大量的ROS生成，有助于其抗肿瘤和抗转移活性。
在此，本研究将ROS敏感的单硫醚键连接的紫杉醇-亚油酸前药（PTX-S-LA）和葫芦素B共同封装到PEG-PCL聚合物中制得双载药胶束，并进一步用肿瘤细胞衍生的外泌体膜修饰，制备外泌体样序贯活化仿生前药纳米平台。该制剂不仅有效地靶向原发肿瘤，而且特异性捕获清除CTCs，从而显著抑制了肿瘤转移。细胞摄取后，纳米粒将首先释放出葫芦素B，从而通过FAK/MMP信号通路调节显著阻断癌细胞的粘附，迁移和侵袭并抑制肿瘤转移。同时，释放的葫芦素B增加了肿瘤细胞中的ROS水平，级联促进了PTX-S-LA前药的活化，起到一石二鸟的作用。该制剂表现出了出色的CTCs靶向能力、增强的前药活化、延长的体内循环时间、更多的肿瘤蓄积和更深的瘤内渗透，在原位和异位MDA-MB-肿瘤模型中均表现出出色的原发性肿瘤抑制和抗转移活性。本文将肿瘤衍生外泌体膜介导的CTCs清除和序贯释药、级联增强的前药生物活化整合到独特的仿生纳米平台中，作为有临床转化前景的二合一纳米治疗平台，为抗乳腺癌转移提供了全新策略。
研
究
内
容
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纳米系统的制备与表征
首先，通过单硫醚键将亚油酸与PTX偶联来制备ROS敏感的PTX前药（图1）。使用乳液溶剂蒸发法将PTX-S-LA和CuB共装载到PEG-PCL纳米粒子中，以制备PCNP，其中P表示PTX-S-LA，C表示CuB。然后将PCNP与EM孵育以获取EMPC。相同的处理方法制备分别装载有PTX-S-LA或CuB的EMP或EMC。图2显示了PCNP的流体动力学直径和形态，它们具有规则的球形形状，平均大小接近80nm。PTX-S-LA和CuB在PEG-PCL纳米颗粒中的载药量分别为9wt％和5wt％，包封率分别为87.6％和69.2％。
使用梯度离心法提取外泌体。通过透射电子显微镜（TEM）成像探究外泌体的碟状结构，以及针对特征性外泌体标记物TSG，CD9和CD81的蛋白质印迹分析，表明外泌体已成功分离。EMPC是通过对提取的外泌体进行低渗处理来制备的。将PEG-PCL纳米颗粒与EM进一步孵育以制备EMPC。通过降低的zeta电位，增加的粒径（?nm）和TEM图像证明PEG-PCL纳米颗粒表面上EM的成功包被。
为了检查仿生外泌体纳米颗粒壳上膜蛋白的存在，按以前的报道进行了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹试验。膜蛋白标记的SDS-PAGE蛋白检查表明，在仿生外泌体纳米颗粒的蛋白质谱中，保留了从EM继承的独特蛋白。CD44和CD47对于肿瘤转移至关重要。CD44是MDA-MB-细胞上的表面粘附分子，在CTC与转移灶的粘附中起关键作用。CD47可以保护肿瘤细胞免受巨噬细胞的吞噬作用，吞噬作用与肿瘤的侵袭有关。如图2D所示，它们共存于癌细胞膜和EM上，并在EMPC中保存良好，以介导同型癌细胞靶向。
然后，用DiI（红色）标记EM，并用香豆素6（C-6，绿色）标记疏水核心，以检查EM完全覆盖PEG-PCL纳米颗粒。将双标记的纳米颗粒添加到MDA-MB-细胞中2h，并用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察。如图2E所示，DiI的荧光与C-6的荧光共定位，表明外泌体仿生纳米颗粒在细胞摄取一段时间后可以保留结构完整性。
图2
图2（A）TEM图像和MDA-MB-衍生的外泌体对TSG，CD9和CD81蛋白的检测。比例尺=nm。（B）EM，EMP，EMC和EMPC的SDS-PAGE蛋白分析。（C）PCNP，EMP，EMC和EMPC的TEM图像。比例尺=nm。（D）对CD44和CD47蛋白进行完整MDA-MB-细胞，MDA-MB-癌细胞膜（CCM），EM和EMPC的蛋白质印迹分析。（E）EM外壳的细胞内共定位（红色）和PEG-PCL核心（绿色）。比例尺=10μm。（F）PCNP，EMP，EMC和EMPC的流体动力学直径和Zeta电位。
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PTX-S-LA的ROS反应性和体外药物释放实验
为了研究PTX-S-LA对ROS的反应性，使用H2O2作为ROS模拟物。如图3A所示，在没有H2O2的情况孵育12小时后，仅10％的PTX从PTX-S-LA释放。相比之下，PTX-S-LA在6小时内在10mM的H2O2存在下释放了近％的PTX，表明PTX-S-LA具有出色的ROS敏感生物激活能力。此外，将EMPC与不同浓度的H2O2孵育以探索顺序生物激活过程。在不存在H2O2的情况下孵育12小时后，大约94％的CuB释放速度比PTX-S-LA（4％）快。相比之下，在加入H2O2之后，PTX-S-LA的PTX释放百分比以H2O2浓度依赖性方式增加，并在与10mMH2O2孵育后12小时内急剧达到95％（图3B）。
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细胞毒性实验
随后，作者通过MTT法检测了MDA-MB-细胞的细胞毒性。图3C和3D显示，由于前药的生物激活延迟，EMP的细胞毒性远低于紫杉醇。这是由于C2-羟基被阻断，这对PTX的抗肿瘤功效至关重要。相比之下，与紫杉醇相比，EMPCs具有更好的癌细胞杀伤能力。
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细胞ROS评估和细胞内药物释放实验
为了研究ROS的产生，将用不同制剂孵育的MDA-MB-细胞用2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色。与EMPs孵育后，ROS水平未表现出增强，而负载CuB的EMC和EMPC则大大提高了细胞内ROS水平（图3E）。为了进一步定量CuB诱导产生的ROS量，在处理2、6或12h后，用流式细胞仪检测荧光强度。EMC和EMPC在12小时内以时间依赖性方式显着提高了细胞内ROS水平（图3F）。因此，共同负载的CuB可以增强MDA-MB-细胞中的ROS水平，从而进一步增加前药的生物活化。受ROS检测结果的鼓舞，研究进一步检测了与MDA-MB-细胞孵育6或24小时后从EMPC和EMP中释放的PTX。如图3G所示，EMPC的PTX释放量远高于EMP的释放量，与体外药物释放结果非常吻合。
图3
图3（A）在H2O2存在下将PTX-S-LA转化为PTX。（B）具有不同浓度H2O2的EMPC中CuB和PTX的体外药物释放曲线。EMC，EMP，Taxol和EMPC对MDA-MB-细胞的（C）48小时和（D）72小时的细胞毒性。（E）与空白培养基，EMP，EMC或EMPC孵育后，用DCFH-DA染色的MDA-MB-细胞的荧光显微镜图像和（F）流式细胞术分析。比例尺=20μm。（G）孵育6小时和24小时后，MDA-MB-细胞中EMP和EMPC的PTX释放量（**P0.01，*P0.05，n=3）。
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MDA-MB-细胞的体外靶向
接下来，研究了C-6标记的PEG-PCL纳米颗粒（C-6NPs），C-6标记的红细胞膜包被的PEG-PCL纳米颗粒（RM
C-6NPs）和C-6标记的在MDA-MB-，MCF-7和NIH3T3细胞中包被外泌体的纳米颗粒（EMC-6NPs），以确认外泌体仿生纳米颗粒的同型癌细胞靶向能力。进行了红细胞膜对PEG-PCL纳米粒子的修饰，以验证EM上的蛋白质在促进MDA-MB-细胞内在化方面的关键作用。如图4A所示，C-6NPs和RMC-6NPs的C-6荧光比EMC-6NPs的荧光低，这表明细胞摄取的提高归因于外泌体上的蛋白质。同时，将MCF-7和NIH3T3细胞设为阴性对照，这进一步说明，用EM修饰纳米颗粒可特别增强同一来源癌细胞的内在化。然后用流式细胞仪检测靶向作用的定量。如图4B所示，在MDA-MB-细胞中，EMC-6NP的荧光信号比C-6NP和RMC-6NP的荧光信号高3.5倍。相比之下，与C-6NP和RMC-6NP相比，EMC-6NP在MCF-7和3T3细胞中未显示荧光增强。以上提到的所有结果表明，仿生外泌体纳米颗粒对同型癌细胞具有选择性亲和力。6
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巨噬细胞RAW.7细胞的细胞摄取
然后，验证了外泌体上的CD47对巨噬细胞吞噬能力的作用。将接种于12孔板的小鼠巨噬细胞RAW.7细胞与C-6NP，RM
C-6NP和EMC-6NP孵育。如图4C所示，RMC-6NP和EMC-6NPs表现出比C-6NPs低得多的内在化。对于流式细胞仪定量分析，与RMC-6NP和EMC-6NP相比，C-6NP的荧光强度增加了3.1倍。结果证实，RM和EM上的CD47均可抑制巨噬细胞的吞噬作用。图4
图4（A）CLSM图像和（B）流式细胞仪分析用C-6NP，RM
C-6NP和EMC-6NP共孵育的MDA-MB-，MCF-7，NIH3T3细胞。细胞核用Hoechst（蓝色）染色，纳米颗粒用C-6（绿色）标记。（C）在巨噬细胞RAW.7细胞中孵育2小时的C-6NP，RMC-6NP和EMC-6NP的流式细胞术检测细胞内摄取成像和（D）细胞内荧光强度。比例尺=15μm。7
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肿瘤球体渗透和伤口愈合分析
进行了MDA-MB-细胞球体评估外泌体仿生纳米粒子的肿瘤空间渗透能力。将球体与C-6溶液，C-6NP和EM
C-6NP孵育8小时。CLSM图像显示，来自EMC-6NPs的C-6的荧光信号在癌细胞球体的深处要比C-6溶液和C-6NPs的荧光信号高（图5A），表明仿生纳米颗粒的深度肿瘤渗透能力。由于癌细胞的迁移与肿瘤转移有关，因此通过伤口愈合试验对MDA-MB-细胞检查了不同制剂（对照，EMP，EMC和EMPC）的迁移抑制作用。治疗24小时后，对照组的伤口间隙几乎消失了。此外，与EMPs组相比，在EMCs和EMPCs处理组中，细胞迁移能力明显受到抑制（图5B），证明了CuB具有良好的抗转移作用。8
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蛋白质印迹
进行蛋白质印迹分析以检测与肿瘤转移相关的关键蛋白分子的表达水平。先前的研究发现了FAK/MMP信号通路在癌症迁移和侵袭中的作用，包括细胞外基质被基质金属蛋白酶（MMP）降解以逃避原发肿瘤并形成粘着斑。为了评估不同制剂对FAK/MMP信号通路的作用，检测了细胞裂解物中活化的FAK（磷酸FAK，p-FAK），FAK，MMP-9和MMP-2的表达。与伤口愈合试验一致，EMC和EMPC与EMP相比，显着抑制了FAK/MMP信号通路（图5C），进一步证实了CuB介导的抗转移作用。
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药代动力学
接下来，研究了紫杉醇，CuB溶液，PCNP和EMPC在大鼠中的药代动力学特征。如图5D，所示，在静脉内施用紫杉醇或CuB溶液后，PTX和CuB迅速从血液循环中消除。EMPC和PCNP与紫杉醇或CuB溶液相比，血液循环时间延长。这表明CD47对EM的自我保护能力并显著抑制巨噬细胞的吞噬作用。
图5
图5（A）与MDA-MB-肿瘤球体孵育的C-6溶液，C-6NP和EM
C-6NP的体外渗透。比例尺=μm。（B）在0、12和24h对MDA-MB-细胞上的对照，EMP，EMC和EMPC进行伤口愈合评估的图像。（C）EMP，EMC和EMPC对FAK/MMP信号通路蛋白表达水平的影响。（D）在单次静脉注射紫杉酚，PCNP或EMPC后，血浆中药物浓度随时间变化。10
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PBS中CTC的体外捕获
然后，制备磁珠（MBs）和涂有EM的磁珠（EM
MBs），以研究EM仿生纳米颗粒的体外CTC捕获能力。在30rpm下与MDA-MB-细胞共孵育1小时后，使用外部磁体分离捕获的细胞。值得注意的是，数据分析显示EMMBs的CTC捕获效率更高（图6A），这可能归因于EM上的粘附分子CD44。11
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CTC的体内清除
在体外研究的鼓励下，继续研究了EMPC消除循环系统中CTC的潜力。静脉注射生理盐水，PCNP和EMPC后，对免疫系统受到抑制的裸鼠静脉注射MDA-MB-细胞作为CTC模拟物。给药后15天，通过ISET技术用聚碳酸酯膜（回旋加速器，8μm）过滤分离血液中的CTC。如图6B所示，EMPC的CTC消除效率是PCNP的3.2倍，证实了EMPC具有优异的体内CTC清除能力。血液中的CTC可能扩散到各个主要器官，尤其是肺。如图6C和D所示，用盐水处理的小鼠在肺中具有显着的转移。用PCNPs处理的小鼠的肺微转移数目略有减少。相比之下，在经EMPC处理的小鼠的肺中观察到的转移性结节微不足道，这表明EMPC可以通过粘附分子CD44在全身循环中靶向CTC，并通过顺序的前药生物激活作用进一步中和CTC。
图6
图6（A）体外CTC在PBS中捕获EM
MBs和MBs的效率。（B）PCNP和EMPC的体内CTC消除效率（***P0.，n=5）。（C）Bouin溶液染色了整个肺部以及从盐水，PCNP和EMPCs组收集的肺切片的H＆E染色的图片。红色圆圈显示可见的转移部位。黄色箭头表示肺转移。比例尺=μm。（D）可见转移结节的定量（***P0.，**P0.01，n=5）。12
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MDA-MB-原位肿瘤模型的研究
然后，比较了原位MDA-MB-荷瘤小鼠中DiRNP和EM
DiRNP的肿瘤靶向能力。EMDiRNPs在给药12h后在肿瘤部位表现出最高的荧光信号，比DiRNPs强得多，此外，肿瘤组织中EMDiRNPs的离体荧光强度比其高3.1倍，表明了仿生外泌体纳米颗粒具有出色的靶向能力。受生物分布结果的鼓励，进一步监测了肿瘤组织中生物激活的PTX释放性能。如图7D所示，EMPCs组中释放的PTX的浓度是EMPs组中的2.9倍，进一步证实了体内CuB介导的放大的前药生物活化。在用各种制剂治疗的原位MDA-MB--luc荷瘤小鼠中进一步评估了治疗功效。如图8A所示，在盐水处理组中，肿瘤体积从初始值mm3明显增加至mm3。EMCs和紫杉醇组的肿瘤体积在30天内达到mm3和0m3，表明对肿瘤的抑制作用较差。EMPs和PCNPs组使肿瘤体积显著变小，在治疗30天结束时，肿瘤大小分别为mm3和mm3。此外，EMPC在H＆E染色的肿瘤切片中显示出最佳的抗肿瘤活性（30天时约mm3），证明了EM相关同型靶向和CuB介导的前药生物激活对抑制肿瘤生长的重要作用。为了验证EMPC的抗转移活性，治疗30天后用IVIS生物发光分析了切除的肺。如图8D所示，盐水和紫杉醇组表现出严重的肺转移和高生物发光强度。相比之下，EMPs和PCNPs组的生物发光信号在一定程度上降低了。与肿瘤体积的增加不同，EMCs组的生物发光强度与EMPCs组的相似。如图8E所示，Bouin溶液染色和H＆E染色结果进一步证实了EMC的出色抗转移能力，与盐水，紫杉醇，EMP和PCNPs组相比，其在肺和肝中的肿瘤转移更少。此外，EMPCs组在肺和肝组织中未显示出明显的癌症转移。因此，负载CuB的外泌体包被纳米粒子可作为一种有前途的纳米平台，用于高效抑制乳腺癌转移，并在前药纳米平台策略中引入级联扩增的生物激活作用。图7
图7（A）在注射DiRNP和EM
DiRNP后的2、8、12和24小时，对原位MDA-MB-荷瘤小鼠进行体内荧光成像。（B）离体荧光成像和（C）施用后24小时收获的主要器官和肿瘤的ROI分析。（D）注射后12h肿瘤中EMPs和EMPCs的（PTX）释放量（***P0.，n=3）。图8
图8（A）用各种制剂处理的原位MDA-MB-肿瘤模型的肿瘤体积的生长曲线。（B）在不同制剂治疗期间原位MDA-MB-肿瘤模型的肿瘤重量变化。（C）最后治疗后的肿瘤图。（D）在不同处理之后切除的肺的离体生物发光图像。（E）治疗结束时Bouin的肺部染色照片和H＆E的肺和肝切片染色照片。红色圆圈显示可见的转移部位。黄色和红色箭头分别显示了肺和肝转移。比例尺=μm。（F）小鼠体重的变化（***P0.，**P0.01，*P0.05，n＝5）。
总
结
思
考
恶性肿瘤都会通过血液传播转移到身体的其他器官，而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞CTC，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶。因此越早发现并治疗血液中的CTC，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的作用，也可以直接做为制剂治疗肿瘤的重要治疗对象。作者使用了序贯激活的纳米粒，使得在激活前极大的保证了制剂的生存周期，使得有效成分尽可能多地在目标部位释放药效，是一种很好的制剂方向的学习方向。我们可以学习本文的研究思路，先对于治疗目标的特征性靶点设计靶向载体，再根据肿瘤特征环境设计逐步激活的通路依次给药，使得药效的最大化。
作者开发了一种乳腺癌靶向的可编程生物激活前药纳米平台，用于乳腺癌的抗转移治疗。EMPC可以通过粘附分子CD44跟踪和捕获CTC。细胞摄取后，释放的CuB不仅通过下调FAK/MMP信号通路抑制肿瘤转移，而且显着提高细胞内ROS水平，从而触发级联扩增的PTX化疗。由于CTC侵入血液的时间可能不同且随机，因此在诊断后必须及时对CTC进行治疗。因此，有效的CTCs捕获和早期治疗是抗CTCs治疗的两个关键点，正确的抗CTCs治疗可以在转移灶形成之前抑制肿瘤细胞团中的转移。由于良好的CTC靶向能力，增强的前药生物活性，延长的全身循环，增强的肿瘤蓄积和更深的肿瘤渗透性，EMPC在MDA-MB-肿瘤模型中表现出极好的的原发肿瘤消退和出色的抗转移活性。因此，外泌体包载前药纳米组装，整合了转移抑制作用并促进了前药的生物激活到一个平台，为基于机制的肿瘤转移抑制开辟了新途径。
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