AnalChem使用高光谱受激拉曼

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基于组织钙化可对乳腺肿瘤恶性程度进行精确评估，这对疾病诊断及了解肿瘤发展过程非常关键。传统的X光钼靶可提供钙化的整体形态但缺乏化学信息。自发拉曼光谱可提供详细的化学数据但缺乏空间分布信息。复旦大学研究人员YifanYang等基于光谱和空间域分析，应用高光谱受激拉曼散射（SRS）显微术来提取微钙化的化学和形态特征。成像了23例患者的共个钙化点，并用基于支持向量机（SVM）的分类算法对结果进行了分析。通过优化微钙化的化学及几何特征组合，使良性和恶性病例的区分精度能达到98.21%，召回率.00%，相较基于纯光谱学或成像的方法有显著改善，可实现新鲜组织的快速准确评估。文章以“Microcalcification-BasedTumorMalignancyEvaluationinFreshBreastBiopsieswithHyperspectralStimulatedRamanScattering”为题发表于AnalyticalChemistry。背景乳腺癌是女性癌症相关死亡的第二大原因，每年占所有癌症病例的23%。恶性肿瘤的早期和准确诊断可极大帮助降低发病率和死亡率，减轻患者经济负担。目前早期检测的主要筛查工具是X光钼靶（X-raymammography），其中钙化被认为是了解和评估疾病的重要特征。这些钙沉积物中包含丰富的化学成分混合物（如磷酸盐、草酸盐和碳酸盐），以及与肿瘤发展和恶性肿瘤密切相关的各种形态信息（大小、形状和分布）。然而X光钼靶仅能提供钙化的形态学特征而没有化学成分信息，并不足以精确评估肿瘤状态。因此结合乳腺钙化的化学和组织学特征的方法对于提高诊断准确性至关重要。基于分子键振动的指纹光谱特征的拉曼光谱可提供卓越的化学识别能力。与用于表征乳房钙化的其他光学方法相比，拉曼散射的特点在于揭示内在的组织和生物矿物的化学成分。已经证明根据草酸钙（CAO）、羟基磷灰石（Hap）和碳酸盐的光谱特征，拉曼光谱可区分不同类型乳房钙化。已知I型钙化是透明的，由CAO晶体组成，这种钙化只发现于良性导管囊肿中，癌中很少发现；而II型钙化是不透明的，主要由钙Hap组成，钙Hap存在于良性和恶性疾病中，但Hap中碳酸盐的丰度显示与恶性肿瘤呈负相关。此外钙化中的蛋白质水平也与恶性肿瘤相关。但自发拉曼散射截面成像速度过慢（约每帧一小时），不能提供足够的被认为与疾病状态相关的形态学信息。如根据乳腺成像报告和数据系统（BI-RADS），放射技师会将“爆米花样”钙化物归入低风险类别。没有空间分辨率的情况下，自发拉曼光谱仅能提供关于异质钙化复合体的空间平均化学信息。为将光谱和空间域信息连接起来，研究人员应用高光谱受激拉曼散射（hyperspectralstimulatedRamanscattering,SRS）显微术来研究微钙化。作为一种新的化学成像方式，SRS信号强度和成像速度提高了几个数量级，同时保持了化学分析的不失真谱线形状。与传统自发拉曼散射不同，当泵浦（ωp）和斯托克斯脉冲（ωs）同时与键振动（频率Ω）相互作用时，SRS从受激发射过程中得到增益，键振动与两个激光束之间的拍频共振（Ω=ωp-ωs）。SRS在各研究领域显示出广泛的应用潜力，特别是生物和生物医学研究领域，包括肿瘤的无标记诊断、化学分析、细胞代谢、药物输送、生物燃料等。当进一步与机器学习算法结合时，SRS在自动与智能诊断的快速无标记组织学应用方面显示出巨大成功。虽然已有研究尝试过用SRS光谱分析在薄组织切片中评估乳房钙化，但还没有过将化学和组织病理学信息集成到一起用在肿瘤评估中。另外新鲜组织活检更适合形态学成像和特征提取，没有通常在冷冻组织切片中出现的切片及冷冻伪影。因此对新鲜组织中的微钙化进行高光谱SRS成像，将为乳腺肿瘤的恶性程度评估提供新思路。本文使用高光谱SRS评估良性和恶性乳腺病变的各种微钙化中，肿瘤恶性和多维SRS特征之间的相关性。从新鲜人乳腺活检样品中获取钙化的指纹SRS光谱（-1cm-1）和化学选择性图像。使用光谱分析提取检测窗口内的主要化学成分（Hap、碳酸盐和蛋白质），处理图像以提取每个钙化点的主要形态特征（几何和纹理）。最后，利用支持向量机（SVM）对乳腺病变进行分类，通过组合并优化化学和形态学特征，使分类精度得到显著提高。结果01-新鲜乳腺活检的SRS成像全乳X光钼靶成像后，显示出了分散钙化（图1A左），芯针抽吸可能包含丰富钙化的病变进行组织活检。在SRS显微镜下，可对不同化学成分进行选择性成像以揭示其空间分布。在高频C-H拉伸区可以看到整个组织的组织病理学（图1A右），拉曼频率cm-1（CH2拉伸）和cm-1（CH3拉伸）处可见脂质（绿色）和蛋白质（蓝色）分布，而在指纹频率区，cm-1（白色）处可检测到乳腺组织内钙化物（Hap）的分布。同时采用SHG通道对胶原纤维成像（红色）。放大的微钙化部位、细胞区域和结缔胶原纤维等细节处可很容易地观察到乳房组织内的强烈不均匀性（图1B）。图1乳腺活检的典型高光谱SRS成像结果。（A）从X光钼靶区域获取的活检样本多色SRS图像。（B）图A三处放大，显示有钙化、密集细胞和富含脂质（绿色）、蛋白质（蓝色）、胶原纤维（红色）和Hap（白色）的结缔组织区域。（C）乳腺组织、标准BSA和Hap中微钙化的SRS光谱。除每个特定化学图像中显示的空间信息之外，超光谱SRS还可提供任何给定感兴趣空间区域的光谱信息。图1C为具有四个主要拉曼活性峰的钙化的典型SRS光谱。通过比较纯Hap和BSA的SRS光谱，可确定钙化主要由Hap组成（cm-1处有代表性的磷脂振动模式），并混合有一定量的蛋白质（5cm-1和cm-1处的特征苯丙氨酸环呼吸振动模式）。约cm-1处的峰可归因于磷灰石复合物中嵌入的碳酸盐（CO32-）的υ1振动模式，与先前的研究一致。已知碳酸盐取代会影响Hap的拉曼光谱，并且良性和恶性乳腺组织微钙化物中的碳酸盐丰度存在差异。这些微钙化的光谱特征为基于SRS光谱的化学成分分析奠定了基础。因为Ⅰ型钙化仅存在于良性病例中，且检测频率窗口（-1cm-1）中没有出现草酸钙，所以本研究中仅

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